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                                    昌美生物唾液DNA提純過程中的常見問題及解答
                                    作者:管理員    發布于:2015-07-19 10:47:01    文字:【】【】【

                                    1. 針對各種唾液gDNA提純,昌美生物有什么方法?
                                        針對客戶的各種需要,目前我們可用“一管法”、“小柱法”、“一管法結合小柱法”和“磁珠法”來提純唾液DNA。根據客戶需要提純的唾液起始量、樣品數量、手工或者自動化提純、實驗室具有的設備條件不同,我們都可以提供相應的適合用戶的提純方法和試劑盒。如有疑問,請與我們聯系得到具體的幫助。


                                    2. 在應用昌美生物“一管法”提純時,發現有些提純的DNA樣品的OD260/OD280, OD260/OD230 比值低,怎么辦?
                                        一般來說,OD值會受很多因素影響,比如是洗脫液pH、本身鹽的濃度、樣品的濃度、測量方法等,所以樣品的純度,也不能輕易用OD值的高低來決定,將樣品用于下游實驗得到的結果是更重要的指標。
                                    (1)在我們的提純步驟中,當裂解的樣品,在加了我們的結合液(KB6結合液和異丙醇)后,如果溫度低,鹽和蛋白質雜物容易和DNA一起沉淀到結合管的管壁。在冬天,天氣冷,溫度低,如在這種低溫下做提純,可能會引起鹽和蛋白質雜物的污染。建議在加了結合液后,在37℃培養箱或水浴鍋中放2-3 分鐘, 混合樣本好后,放在室溫的離心機離心(不要在4℃離心機進行離心),會減少鹽和蛋白質的污染。
                                    (2)如果在洗脫的DNA有明顯的異物或者雜質,可以再加50 μl的洗脫液到洗脫的DNA樣品中,充分混合,然后高速離心1分鐘, 將上清液體轉移到另一新管存放。
                                    (3)根據我們的實驗和客戶反饋,即使樣品的OD比值低些,但不影響下游的實驗。同樣可很好地用于下游實驗,如PCR、Sequencing、RFLP、NGS等等。
                                    (4)如果需要,可以使用我們的“小柱法”或“一管法結合小柱法”唾液DNA提純試劑盒。

                                    3. 有些樣品在洗脫DNA后有膠質固形物存在,那是什么?怎么可以去掉?
                                        這些膠質固形物是來自粘稠痰液(viscous sputum),病人在收集唾液(saliva)時, 如果口腔咽喉有炎癥,粘稠痰液會多些,使采集到唾液有很多粘稠痰液污染。粘稠痰液的糖蛋白含有大量蛋白質二硫鍵(Di-sulfated bond),使其粘度增加,成膠質狀,而一般蛋白酶K的裂解,不能打斷蛋白質二硫鍵,所以這些樣品在洗脫DNA后有膠質固形物存在。但這些膠質固形物一般不影響下游的實驗。
                                    怎么去掉這些膠質固形物?
                                    (1)在提純時:在加蛋白酶K進行62°C裂解后,在裂解液中加二硫蘇糖醇(dithiothreitol) 使其終濃度是 50 μg/ml(需自備1000 μg/ml dithiothreitol),然后將樣本置于37°C溫育20分鐘,同時間歇混合樣品使其充分混合好。 Dithiothreitol 可以裂解黏液的糖蛋白二硫鍵,從而降低樣品的粘度,使痰液化,就好在提純過程中,去掉痰的污染,并允許容易的處理和加工。 
                                    (2)在提純后:如果要去掉這些膠質固形物,在洗脫DNA樣品里再加300 μl的洗脫液,充分震蕩(Vortex)樣品,然后,高速離心3 分鐘,吸取上面的液體到一個新的結合管(不要下面的膠質固形物)。然后加等體積的結合液(KB6 + 異丙醇)(大約300 μl)。高速離心3 分鐘,去掉液體, 然后,用 300 μl 的 Washing Buffer(WB2)洗一次, 離心,去掉液體, 加100 μl 洗脫液洗脫DNA。

                                    4. 一管法和小柱法,各有那些特點:
                                        “一管法”提純gDNA優點是方法簡單,處理樣品起始量多,可以處理1 ml、2 ml或者 4 ml的唾液混合液。得到的DNA產量高,但OD260/OD280較“小柱法”確實會偏低點,但一般不會影響下游實驗。

                                        “小柱法”是用我們特別的硅膜方法,使用常規離心柱步驟,得到的純度高,樣品的起始量是300 μl(而Qiagen的小柱法的起始量是200 μl ),如果需要,還可以處理600 μl 的起始量。

                                    5. 能否用更大體積的唾液來提取DNA?
                                        可以,如果需要,可以將4 ml唾液混合液全部用來進行DNA提純。我們有針對各種唾液起始量的提純方法,如4 ml、2 ml、1 ml、 600 μl  或者 300 μl 的唾液混合液。請與我們聯系,您將得到最適合您的提純方法。

                                    6. 如果使用Qiagen的小柱法來提純用昌美生物唾液收集瓶保存的唾液DNA,還需要使用Qiagen的裂解液嗎?
                                        需要,因為Qiagen的裂解液的成分沒有明確地告訴用戶,其實,其裂解液的功能不僅使細胞裂解、還能使DNA結合到硅膜上面,在提純用昌美生物唾液收集瓶保存的唾液DNA時,如果沒有加Qiagen的裂解液,DNA就不能結合到硅膜上,DNA的產量就非常低。
                                        昌美生物的小柱法,是特別針對昌美生物唾液收集瓶保存的唾液DNA提純開發的產品,方法比Qiagen的更簡單,并且可以處理的唾液混合樣品的起始量是300 μl,而Qiagen小柱法的起始量是200 μl。所以,使用昌美生物是小柱法,產量要提高50%以上。

                                    7. 唾液DNA提純后, 用什么方法檢測DNA為好?

                                        當用UV Absorance方法來檢測提純的DNA,由于這種方法不能區分DNA和RNA,殘留的RNA會增加OD值,過高估計DNA的產量,另外,降解的DNA片段也會增加OD值,所以我們建議用能和DNA特異結合的熒光染料(fluorescent dye)法來檢測提純的DNA產量。

                                        另外,Nanodrop 在測 10 ng/μl  以下的DNA樣品時,由于機器本身的靈敏度的限制,所測值是不可靠的。所以,當DNA濃度低于10 ng/μl  時,用Nanodrop測得的 OD260/OD280值以及 OD260/OD230值都是不可靠的。在這種情況下,不要用OD值來推斷樣品中鹽濃度的高低。

                                    8. 為什么唾液DNA的含量各人不一樣?一般來講,提純的唾液DNA量有多少?
                                        唾液中DNA的含量,會因人而異,變化比較大。一般來講,從一個健康人采集2 ml唾液,可以獲得15 μg- 200 μg的gDNA。
                                    其它影響DNA產量的因素:
                                    (1)唾液采集方法;
                                    (2)唾液gDNA提純方法的效率高低;
                                    (3)DNA提純后的DNA定量檢測方法。

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